近日，P53/ target=_blank class=infotextkey>P53激动剂 nutlins 的开发又遇到了挫折。尽管如此，药物开发者仍将继续在这个肿瘤靶点上付出更大的努力，以寻找新型P53靶向疗法。肿瘤免疫、装订肽（stapled peptides）和PROTAC（PROteolysis TArgeting ChimeRAS）这些近年快速发展的新技术能彻底释放p53这个“基因组守护神”的治疗潜力吗？
（图源：S.Harris/Springer Nature Limited）
2003年，还在罗氏公司（Roche）工作的Lyubomir Vassilev开始撰写一篇论文，报道他发现的可抑制p53-MDM2相互作用的小分子。他早就知道这会是篇大文章——p53是癌症中突变频率最高的基因，而他的团队发现了可以选择性增强p53肿瘤抑制活性的化合物。他放弃了用公司代码来命名化合物的惯例，而是以发现这些化合物的工厂所在位置——新泽西州的Nutley来命名这些化合物。
Lyubomir Vassilev认为，nutlins将会成为一个“家喻户晓”的名字，而一个复杂的名字不利于化合物的应用和开发。“这个想法曾经遭到管理层的强烈反对，但我没有退缩，”他回忆道。
这项研究发表在2004年的Science 杂志上【1】，首次向人们展示一项在罗氏持续了20多年的研究。p53这个靶点吸引了赛诺菲（Sanofi）和默克（Merck）等竞争对手，重新激发了大家对蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPIs）的兴趣。根据Google Scholar，这篇文章被引用了4365次。自发表以来，平均每周被引用近5次。
2020年对nutlins来说是另一个具有里程碑意义的一年。罗氏的idasanutlin（新一代nutlin）用于治疗急性髓系白血病的III期临床试验结果于今年公布，并计划在公布后提交相关申请。然而，结果表明，一个药物的发现和开发过程是多么的困难。今年6月，罗氏在欧洲血液学协会大会（European Hematology Association Congress）上宣布，临床III期试验失败。
其他公司的靶向p53-MDM2相互作用的小分子也遭遇了挫折。诺华公司（Novartis）在1月份宣布停止用于急性髓系白血病的siremadlin的开发。安进公司（Amgen）已经将其候选产品AMG-232授权给另一家公司Kartos Therapeutics进行开发。过去10年，强生、赛诺菲和默克等巨头都暂停了这方面的项目。
不光是工业界，学术界也抛弃了p53研究。“我们已经停止了相关的项目，因为我们认为这可能是一条死胡同。” 研究MDM2小分子抑制剂已有十年的药物化学家Lukasz Skalniak说。他认为，这些药物可能对特定的肿瘤发挥作用，但它们不太可能拥有人们曾经希望的、广谱的抗癌活性。
还有一些人仍在坚持，坚信可以破解这个“不可成药”的靶标。小分子抑制剂的发展似乎停滞不前，但快速发展的装订肽（stapled peptides）、PROTAC、甚至是mRNA药物或许能够用于靶向p53。默克公司的高级首席科学家Anthony Partridge正在研究可以使p53“恢复自由”的装订肽。他认为，在付出了很多努力却看不到回报时，人们可能会对它失去兴趣。但只要你发表了很好的数据，这种情况会瞬间扭转。
p53：一个引人注目的癌症靶标
p53首次发现于1979年【2】，人们用SDS-PAGE的方法发现其分子量为53kDa，因此命名为p53，但实际分子量是44kDa。人们最初认为它是致癌因子，直到后来才意识到是一个强大的抑癌蛋白。检测到DNA损伤后，p53会延缓细胞周期，让细胞能够修复损伤。损伤太严重时，p53会诱导细胞凋亡。
一直以来，p53被认为是一个重要的癌症治疗靶标【3】。p53失活突变的个体，有50%的几率在30岁前患上癌症，有90%的几率在70岁前患上癌症。p53敲除的小鼠很快就会出现肿瘤。高达50%的肿瘤都有p53等位基因的突变。因此，人们推测，能够激活p53抑癌能力的药物可能有强大的抗癌活性。
相比于激活一个蛋白，抑制一个蛋白更容易。而抑制p53与MDM2的相互作用，从而激活p53，是其中一个关键的方法（见下图）。MDM2与p53结合，抑制后者的功能。另外，MDM2是一个E3泛素连接酶，介导p53的降解。通过抑制p53与MDM2之间的相互作用，可以恢复野生型p53的抑癌活性。
p53和MDM2在反馈回路中相互作用。p53的活化可以上调MDM2的表达，MDM2反过来可以降低p53的活性。图片改编自Nature Reviews Cancer【4】
然而，PPI（protein-protein interaction）抑制剂的开发是很困难的一件事情。小分子难以结合在两个蛋白之间大而平的表面，而且大蛋白通常不受小分子结合的影响。曾在罗氏从事nutlins研究10多年的Bradford Graves回忆，上世纪90年代末罗氏开始着手研究p53时，他们并不看好PPI抑制剂。罗氏和其他许多公司没有什么不同，他们都担心PPI到底能不能被有效靶向。
MDM2的PPI界面上有一个很深的疏水口袋。在罗氏开始他们的工作之前，诺华公司已经开发出了一种合成的多肽来靶向这个口袋【6】，这打消了罗氏的疑虑。刚开始，寻找化合物的工作进展缓慢，罗氏测试了库中所有的化合物，获得的结果并不理想。其实，这也是意料之内的，因为已经有很多实验室做过这件事情，但没有找到任何东西。
多番努力后，罗氏开始看到了希望。他们最后找到了nutlins。Bradford Graves说，这不仅是MDM2拮抗剂开发的重大进展，也是PPI抑制剂领域的重大进展。
MD安德森癌症中心的肿瘤学家Michael Andreeff 回忆说，nutlins的发现是一件了不起的事情。“我印象非常深刻，当我看到那篇Science上的文章时，我跳了起来。”Michael在一次会议上遇到了Lyubomir Vassilev，随后与罗氏合作进行nutlins的开发工作。
nutlins和艾博维公司（AbbVie）开发的BCL-2抑制剂venetoclax一起【7】，被认为是PPI抑制剂的典范之作。尽管人们对PPI的热情正在逐渐消退，但当下研究火热的KRAS抑制剂重新吸引了大小公司的兴趣，去回顾那些曾经被认为“不可成药”的靶标。
屡屡受挫的MDM2抑制剂
多年来，许多制药公司对MDM2抑制剂进行了大量的投资，但是还没有获批进入市场。
第一个进入临床试验的MDM2抑制剂是罗氏的RG7112【8】，也属于nutlin家族，针对实体瘤和急性髓系白血病的一期临床试验分别于2007年和2008年启动。大约50%的癌症中p53发生了突变，但只有5-10%的急性髓系白血病患者带有p53突变。只有携带野生型p53的患者能够从MDM2抑制剂中获益，因此这种临床试验的设计是有道理的。与此同时，MDM2在急性髓系白血病中过表达，对应的患者可能会从中受益。
但是在这个试验中，病人必须服用非常高剂量的RG7112，导致胃肠道毒性、中性粒细胞和血小板的减少。研究者认为，要避免这些副作用，可能需要一种更有效的MDM2抑制剂【9】。
科学家发现了RG7388/Idasanutlin，它的化学结构与最初的nutlin差别较大【10】。2005年，密歇根大学的药物化学家王少萌首次报道了这种化学结构的活性【11】，他将这种MDM2抑制剂授权给了赛诺菲（Sanofi）和他自己创立的Ascentage Pharma公司。
RG7388/Idasanutlin的临床疗效也不尽如人意。自2011年首次进行人体试验以来，罗氏已经在不同的疾病类型中试验了几种药物组合，唯一进入临床III期的是该药与化疗药物阿糖胞苷联合治疗急性髓系白血病的研究。但罗氏在今年6月的欧洲血液学协会大会上报告称，RG7388/Idasanutlin的疗效一般，这一试验暂时停止。
罗氏也计划把idasanutlin用于一线急性髓系白血病的治疗，因为在未接受过任何治疗的患者身上，积累的耐药突变更少。然而，这项试验也停止了。罗氏旗下的基因泰克公司表示，他们将继续分析，以更好地确定idasanutlin的适应症。
联合用药，新的希望？
（图源：drypharmacist.com）
考虑到其他MDM2抑制剂的临床开发也纷纷失败，人们不会对罗氏的失败感到惊讶。早在2006年，研究人员就意识到，这些化合物并不总是会促进p53介导的癌细胞凋亡【12-14】，可能的原因是下游信号通路的失活。随着时间的推移，癌细胞也会对MDM2抑制剂产生耐药【15】。
更好的癌症基因分型可以对用药起到指导的作用，但这些MDM2抑制剂可能只对某些癌症种类起作用，而不能广谱地用于癌症治疗。因此，我们需要找到其他策略，继续寻找p53激动剂。
一种可能的办法是联合用药。有人乐观地认为，MDM2拮抗剂将在其他药物的帮助下进入市场。联合用药的选项有很多，既提供了机会，也带来了挑战【16】。人们已经提出了几十种联合用药的策略，包括传统的诱导DNA损伤的化疗药物、抗生素、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和治疗性抗体等等。有些组合已经宣告失败，其他的仍在临床试验阶段（见下表）。
正在进行临床试验的MDM2抑制剂
MDM2抑制剂可与BCL-2抑制剂venetoclax联用。2017年发表在Cancer Cell的文章表明，这些试剂可以起到协同的作用【17】。MDM2抑制剂活化了p53，p53促进了MCL-1的降解，从而克服了对venetoclax的耐药。反过来，抑制BCL-2也促进了p53驱动的细胞凋亡。罗氏和艾伯维正在合作推进该组合的临床研究。
日本第一三共公司（Daiichi Sankyo）正在测试MDM2抑制剂milademetan与新一代FLT3抑制剂quizartinib。诺华公司也在做类似的事情。
随着人们对p53的理解逐渐加深，p53在肿瘤免疫中的作用也受到越来越多的关注【18】，把MDM2抑制剂与肿瘤免疫联系在一起的策略也被提出。癌细胞通过p53上调PD-1、PD-L1和DD1α的表达，这些都是抑制T细胞活性的分子。P53在癌细胞中发生了突变，让癌细胞获得了免疫逃避的优势。还有人认为，p53是免疫系统的主要调节因子，尽管免疫学家们不会认同这个观点。
装订肽的登场亮相
MDM2抑制剂不起作用的一种可能解释是，这些化合物太过专一，无法充分激活p53。与MDM2结构类似的MDMX也可以结合并抑制p53活性，起到补偿的作用。爱因斯坦医学院的细胞生物学家Ulrich Steidl说，同时靶向MDM2和MDMX才是成功的关键。
p53的一个螺旋区域可以结合MDM2和MDMX，这个区域为多肽抑制剂的设计提供了模板。虽然多肽的细胞通透性差，但研究人员发现，保持螺旋构象的装订肽兼具稳定性、细胞通透性和细胞活性。
然而，不少人曾经对装订肽策略提出过质疑【19】。Aileron Therapeutics公司自2005年以来一直在开发装订肽，他们的ALRN-6924是MDM2和MDMX的双重多肽抑制剂，正处于临床试验阶段【20】。2018年，Science Translational Medicine上的论文表明，Aileron Therapeutics的ALRN-6924的确具有显著的抗白血病效果【21】。装订肽领域有着巨大的潜力，Ulrich Steidl说。他也是Aileron Therapeutics的科学顾问。
Aileron Therapeutics只是一家预算有限的小型生物公司，他们在2016年启动了ALRN-6924的一期临床试验。现在，该公司已经缩减了临床试验计划，把ALRN-6924用于降低化疗引发的毒副作用，这样做有利于把ALRN-6924尽快推入市场。低剂量的装订肽可以使健康细胞的细胞周期停滞，降低化疗药物对它们的影响。而快速增殖的癌细胞（p53突变）不受MDM2和MDMX抑制剂的影响，化疗药物还是可以杀死它们。
ALRN-6924的临床I/II期数据预计将在今年公布。在这项针对小细胞肺癌的试验中，ALRN-6924被用于减轻拓扑异构酶抑制剂的毒性。与此同时，其他公司也在研究装订肽。默克和新加坡的合作者们正在对装订肽进行优化，提高功效、稳定性、细胞通透性和溶解性，项目负责人包括p53的共同发现者David Lane【22】。
PROTAC的兴起
靶向蛋白质降解是另一种重新激活野生型p53的方法。第一个抑制p53-MDM2相互作用的小分子nutlin在PROTAC的早期发展中扮演了重要的角色。耶鲁大学的PROTAC研究先驱Craig Crews在2008年发现了第一个小分子PROTAC，这些分子用nutlin来招募E3泛素连接酶MDM2，启动目标蛋白的降解【23】。
Craig Crews团队和Arvinas（他创立的PROTAC公司）在2018年发表于Cancer Research的研究证明，招募MDM2的PROTAC可能有双重功效。他们用idasanutlin招募MDM2，这种PROTAC不仅能诱发靶蛋白的降解，而且还能通过阻断p53与MDM2的相互作用而重新激活了p53【24】。
密歇根大学的药物化学家王少萌用不一样的PROTAC来重新激活p53。这一次，他招募了E3泛素连接酶Cereblon来靶向降解MDM2【25】。
PROTAC方法之所以吸引人，在于它所介导的高效的蛋白降解——少量的PROTAC小分子就可以催化大量目标蛋白的降解。这是一个特别吸引人的特征，因为p53重新激活的结果之一是MDM2的表达上调。因此，靶向降解MDM2的PROTAC可以作用得更持久，所需的剂量更低，减少副作用的隐患。
王少萌认为，MDM2降解剂可能比MDM2抑制剂更有效。他正与合作伙伴一起将靶向MDM2的PROTAC推向临床。另外一个课题组也报道了靶向MDM2的PROTAC【26】。
关于p53的发现永远不会停下。最近的一篇Science Translational Medicine 论文中【27】，研究人员发现，mRNA疗法对p53突变癌症患者有潜在的效果。哈佛医学院的施进军课题组用纳米颗粒将p53的mRNA递送到p53缺失的癌细胞中，抑制了癌细胞的生长。把这种方法与mTOR抑制剂everolimus结合时，他们看到了显著的抗肿瘤效果。
p53可以说是人类癌症中最重要的靶点，希望科学家们会继续对此感兴趣，并继续发现新的策略来靶向它。期待p53靶向治疗真正造福于患者的那一天。
参考文献
1. Vassilev LT, Vu BT, Graves B, et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 2004;303(5659):844-848. doi:10.1126/science.1092472
2. DeLeo AB, Jay G, Appella E, Dubois GC, Law LW, Old LJ. Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(5):2420-2424. doi:10.1073/pnas.76.5.2420
3. Lane D, Levine A. p53 Research: the past thirty years and the next thirty years. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(12):a000893. doi:10.1101/cshperspect.a000893
4. Chène P. Inhibiting the p53-MDM2 interaction: an important target for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2003;3(2):102-109. doi:10.1038/nrc991
5. Kussie PH, Gorina S, Marechal V, et al. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science. 1996;274(5289):948-953. doi:10.1126/science.274.5289.948
6. Chène P, Fuchs J, Bohn J, García-Echeverría C, FuRET P, Fabbro D. A small synthetic peptide, which inhibits the p53-hdm2 interaction, stimulates the p53 pathway in tumour cell lines. J Mol Biol. 2000;299(1):245-253. doi:10.1006/jmbi.2000.3738
7. Mullard A. Pioneering apoptosis-targeted cancer drug poised for FDA approval [published cORRection appears in Nat Rev Drug Discov. 2016 Apr;15(4):292]. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(3):147-149. doi:10.1038/nrd.2016.23
8. Vu B, Wovkulich P, Pizzolato G, et al. Discovery of RG7112: A Small-Molecule MDM2 Inhibitor in Clinical Development. ACS Med Chem Lett. 2013;4(5):466-469. Published 2013 Apr 2. doi:10.1021/ml4000657
9. Andreeff M, Kelly KR, Yee K, et al. Results of the Phase I Trial of RG7112, a Small-Molecule MDM2 Antagonist in Leukemia. Clin Cancer Res. 2016;22(4):868-876. doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-0481
10. Ding Q, Zhang Z, Liu JJ, et al. Discovery of RG7388, a potent and selective p53-MDM2 inhibitor in clinical development. J Med Chem. 2013;56(14):5979-5983. doi:10.1021/jm400487c
11. Ding K, Lu Y, Nikolovska-Coleska Z, et al. Structure-based design of potent non-peptide MDM2 inhibitors. J Am Chem Soc. 2005;127(29):10130-10131. doi:10.1021/ja051147z
12. Tsao CC, Corn PG. MDM-2 antagonists induce p53-dependent cell cycle arrest but not cell death in renal cancer cell lines. Cancer Biol Ther. 2010;10(12):1315-1325. doi:10.4161/cbt.10.12.13612
13. Jeay S, Gaulis S, FerRETti S, et al. A distinct p53 target gene set predicts for response to the selective p53-HDM2 inhibitor NVP-CGM097 [published cORRection appears in Elife. 2016 Nov 17;5:null]. Elife. 2015;4:e06498. Published 2015 May 12. doi:10.7554/eLife.06498
14. Tovar C, Rosinski J, Filipovic Z, et al. Small-molecule MDM2 antagonists reveal aberrant p53 signaling in cancer: implications for therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(6):1888-1893. doi:10.1073/pnas.0507493103
15. Skalniak L, Kocik J, Polak J, et al. Prolonged Idasanutlin (RG7388) Treatment Leads to the Generation of p53-Mutated Cells. Cancers (Basel). 2018;10(11):396. Published 2018 Oct 24. doi:10.3390/cancers10110396
16. Kocik J, Machula M, Wisniewska A, Surmiak E, Holak TA, Skalniak L. Helping the Released Guardian: Drug Combinations for Supporting the Anticancer Activity of HDM2 (MDM2) Antagonists. Cancers (Basel). 2019;11(7):1014. Published 2019 Jul 19. doi:10.3390/cancers11071014
17. Pan R, Ruvolo V, Mu H, et al. Synthetic Lethality of Combined Bcl-2 Inhibition and p53 Activation in AML: Mechanisms and Superior Antileukemic Efficacy. Cancer Cell. 2017;32(6):748-760.e6. doi:10.1016/j.ccell.2017.11.003
18. Muñoz-Fontela C, Mandinova A, Aaronson SA, Lee SW. Emerging roles of p53 and other tumour-suppressor genes in immune regulation. Nat Rev Immunol. 2016;16(12):741-750. doi:10.1038/nri.2016.99
19. Okamoto T, Zobel K, Fedorova A, et al. Stabilizing the pro-apoptotic BimBH3 helix (BimSAHB) does not necessarily enhance affinity or biological activity. ACS Chem Biol. 2013;8(2):297-302. doi:10.1021/cb3005403
20. Chang YS, Graves B, Guerlavais V, et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(36):E3445-E3454. doi:10.1073/pnas.1303002110
21. Carvajal LA, Neriah DB, Senecal A, et al. Dual inhibition of MDMX and MDM2 as a therapeutic strategy in leukemia. Sci Transl Med. 2018;10(436):eaao3003. doi:10.1126/scitranslmed.aao3003
22. Partridge AW, Kaan HYK, Juang YC, et al. Incorporation of Putative Helix-Breaking Amino Acids in the Design of Novel Stapled Peptides: Exploring Biophysical and Cellular Permeability Properties. Molecules. 2019;24(12):2292. Published 2019 Jun 20. doi:10.3390/molecules24122292
23. Schneekloth AR, Pucheault M, Tae HS, Crews CM. Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18(22):5904-5908. doi:10.1016/j.bmcl.2008.07.114
24. Hines J, Lartigue S, Dong H, Qian Y, Crews CM. MDM2-Recruiting PROTAC Offers Superior, Synergistic Antiproliferative Activity via Simultaneous Degradation of BRD4 and Stabilization of p53. Cancer Res. 2019;79(1):251-262. doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-2918
25. Li Y, Yang J, Aguilar A, et al. Discovery of MD-224 as a First-in-Class, Highly Potent, and Efficacious Proteolysis Targeting Chimera Murine Double Minute 2 Degrader Capable of Achieving Complete and Durable Tumor Regression. J Med Chem. 2019;62(2):448-466. doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00909
26. Wang B, Wu S, Liu J, Yang K, Xie H, Tang W. Development of selective small molecule MDM2 degraders based on nutlin. Eur J Med Chem. 2019;176:476-491. doi:10.1016/j.ejmech.2019.05.046
27. Kong N, Tao W, Ling X, et al. Synthetic mRNA nanoparticle-mediated restoration of p53 tumor suppressor sensitizes p53-deficient cancers to mTOR inhibition. Sci Transl Med. 2019;11(523):eaaw1565. doi:10.1126/scitranslmed.aaw1565